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正文:

光學(xué)顯微鏡觀察
依據(jù) Christie and Edwardson (1977) (7) 之 C a l c o m i n e
orange-Luxol brilliant green 染色法觀察內(nèi)含體。撕取洋桔梗罹病葉片表皮并以 5% Triton X-100 處理 5 分鐘。再以
1% Calcomine orange -1% Luxol brilliant green 染液 ( V / V＝
9: 1 ) 染色 1 0 分鐘后吸除殘馀染液，在 9 5 % 酒精中脫色 1 0 -
2 0 秒，放入 2 -甲氧基乙基醋酸 ( 2 - m e t h o x y e t h y l a c e t a t e ) 中
1 0 - 1 5 分鐘，于載玻片上封片，再行光學(xué)顯微鏡檢，并以
健康植株做為對(duì)照。
電子顯微鏡觀察
陰染法：機(jī)械接種 L N V 發(fā)病之洋桔�；蚩�藜葉片組
織粗汁液與 0.1% bacitracin (1 : 1 ) 溷合，依 Christie et al.
( 1 9 8 7 ) 方法 (8) 以銅網(wǎng)吸附前述溷合液，再以 2 % 醋酸鈾
(uranyl acetate) 染色；純化之病毒懸浮液經(jīng) 2 % 甲醛
( f o r m a l d e h y d e ) 固定后，依前述方法染色并以電子顯微鏡
(JEM-200CX, JEOL) 觀察病毒顆粒之形態(tài)。
超薄切片法：經(jīng)機(jī)械接種之洋桔梗罹病葉片及花器等
組織，分別以 2 % 戊二醛 ( g l u t a r a l d e h y d e ) 及 1 % 四氧化鋨
(osmium tetroxide) 做前、后固定，再以酒精系列脫水和
LR White 樹脂滲透包埋后，于超薄切片機(jī) ( R e i c h e r t
ultracut S) 切取 60-70 nm 厚度的切片，經(jīng) 2 % 醋酸鈾溶液
染色后以電子顯微鏡觀察罹病組織之病變情形。
抗體
試驗(yàn)使用之抗體包括 L N V 老鼠單元抗體細(xì)胞培養(yǎng)液
( 7 E S - 3 G - 1 0 ) 由國(guó)立中興大學(xué)植病系陳煜焜老師製備供
用；L N V 日本分離株兔子抗血清由 D r. Iwaki (15) 贈(zèng)用；
L N V 臺(tái)灣分離株兔子抗血清由本實(shí)驗(yàn)室製備，製備時(shí)將
純化之病毒經(jīng)電泳分離 ( 11 )，析取 38 kDa 病毒鞘蛋白做為
抗原，每週一次，經(jīng)連續(xù)四次肌肉注射紐西蘭白兔，第五
週起進(jìn)行耳朵靜脈採(cǎi)血，所得抗血清，保存于 - 4 0℃ 備
用。本試驗(yàn)僅于初期鑑定病毒種類時(shí)使用日本分離株兔子
抗血清，其馀相關(guān)之血清學(xué)試驗(yàn)均使用 L N V 臺(tái)灣分離株
兔子抗血清 (除有說明需要，以下均簡(jiǎn)稱兔子抗血清) 或老
鼠單元抗體細(xì)胞培養(yǎng)液 (除有說明需要，以下均簡(jiǎn)稱老鼠
單元抗體)。
酵素連結(jié)免疫分析
間接酵素連結(jié)免疫分析 (indirect ELISA) 係依 K o e n i n g
( 1 9 8 1 ) (17) 之方法進(jìn)行。供試植物葉片以 9 倍量 ( W / V ) 之涂
覆緩沖液 (coating buff e r, 1.59 g Na2C O3，2.93 g NaHCO3，
0.2 g NaN3，1000 ml H2O，pH 9.6) 研磨，取 2 0 0μl 置入
微量盤之孔穴中，于 3 7℃ 靜置 2 . 5 小時(shí)后用 PBST (8 g
N a C l， 0.2 g KH2P O4，2.9 g Na2H P O4，7 H2O，0.2 g
K C l，0.2g NaN3，0.5 ml Tw e e n - 2 0，1000 ml H2O，p H
7 . 4 ) 清洗 3 次。加入以結(jié)合緩沖液 (conjugate buff e r, 2%
P V P - 4 0，0.2% ovalbunin ，1000 ml PBST) 稀釋 1 0 0 0 倍之
L N V 免子抗血清或稀釋 8 倍之細(xì)胞培養(yǎng)液老鼠單元抗體，
于 3 7℃ 靜置 2 小時(shí)，用 P B S T 清洗 3 次，再加入以結(jié)合緩
沖液稀釋 5 0 0 0 倍之鹼性磷酸酵素標(biāo)示之山羊抗兔子免疫
球蛋白 (goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate,
J a c k s o n )，老鼠單元抗體則加入 1 0 0 0 倍之山羊抗老鼠免疫
球蛋白 (goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate,
J a c k s o n )。三層酵素連結(jié)免疫分析 (triple-antibody sandwich
ELISA, TAS- ELISA) 係依據(jù) Hsu and Lawson (13) 之方法進(jìn)
行，依序加入 L N V 免子抗血清球蛋白 ( 1 : 2 0 0 0 )、3 %
bovine serum albumm (BSA)、抗原、L N V 老鼠單元抗體細(xì)
胞培養(yǎng)液 ( 1 : 8 )，最后加入以 conjugate buff e r 稀釋 1 0 0 0 倍
之 goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate,
J a c k s o n。兩種方法最后均于 3 7℃ 靜置 2 小時(shí)或 4℃ 過
夜，水洗后，每穴加入 2 0 0μl 以 substrate buffer (97 ml
d i e t h a n o l a m i n e，800 ml H2O，0.16 g NaN3，p H 9 . 8 ) 配製
之酵素基質(zhì) (ρ-nitrophenyl phosphate，disodium, Sigma, 1
m g / m l ) 試液反應(yīng) 2 0 - 6 0 分鐘，每穴再加入 5 0μl 之 3 M
N a O H 停止反應(yīng)，并以 E L I S A 測(cè)讀儀 ( B i o - Tek Instruments,
Burlington, VT, USA) 讀取波長(zhǎng) 405 nm 之吸收值。健康對(duì)
照A 4 0 5 之讀值的 3 倍為正反應(yīng)之判定依據(jù)。
組織轉(zhuǎn)漬法
直接組織轉(zhuǎn)漬法 (direct tissue blotting，D T B ) 依 Lin e t
a l. (1990) (18) 及 Hsu and Lawson (1991) (14) 之方法進(jìn)行。將
接種 L N V 發(fā)病之洋桔梗葉片撕起表皮或取其根、莖部
位，適力壓漬于亞硝基樹脂膜 (nitrocellulose membrane,
nitroscreen, DuPont)，隨后浸于內(nèi)含 2% BSA 與 1% Tr i t o n

X - 1 0 0 之 P B S，室溫振盪 6 0 分鐘后，浸于以 P B S稀釋之
L N V 兔子抗血清 ( 1 : 1 0 0 0 ) 或老鼠單元抗體細(xì)胞培養(yǎng)液 ( 1 :
8 ) 于室溫放置 2 小時(shí)或于 4℃ 過夜。連續(xù)三次以 P B S T 溶
液清洗 ( P B S 內(nèi)含 0.05% Tween 20)，每次 1 0 - 1 5 分鐘。亞
硝基樹脂膜隨之即浸于以結(jié)合緩沖液稀釋 5 0 0 0 倍之 g o a t
anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Jackson于室
溫放置 2 小時(shí)，以 P B S T 連續(xù)清洗三次，每次 1 0 - 1 5 分
鐘，再行顯色。
西方轉(zhuǎn)漬法
西方轉(zhuǎn)漬法( Western blot)分析時(shí)係將L N V罹病組織萃
取粗汁液 (粗汁液先經(jīng) 1,000 rpm 離心 1 0 分鐘) 或純化病毒
懸浮液以解離緩沖液 (degrading buff e r ) 處理并于沸水煮 2
分鐘后經(jīng)S D S - PA G E電泳分離后，根據(jù)Gooderham (1984)( 1 2 )
之方法以蛋白轉(zhuǎn)印槽 (Bio-Rad transblot apparatus) 將電泳
膠上之蛋白轉(zhuǎn)印到轉(zhuǎn)漬膜 (PVDF membrane, Millipore)
上，P V D F 轉(zhuǎn)漬膜經(jīng)浸于轉(zhuǎn)印緩沖液 (transfer buff e r ) 清洗
后，再以對(duì)應(yīng)兔子抗血清稀釋液 ( 1 : 1 0 0 0 ) 或 L N V 老鼠單
元抗體細(xì)胞培養(yǎng)液 ( 1 : 8 ) 浸漬，P V D F 膜以 T S W 緩沖液
(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.9% NaCl, 0.25% gelatin, 0.1%
Triton X-100, 0.02% SDS) 清洗后浸泡于 goat anti-rabbit
IgG alkaline phosphatase conjugate, Jackson (1 : 5 0 0 0 )，
P V D F 膜再以 T S W 緩沖液清洗，最后行呈色反應(yīng)。
病毒之接種及偵測(cè)
L N V 罹病洋桔梗葉片粗汁液以金鋼砂機(jī)械接種于 5 - 6
葉期洋桔梗幼苗展開葉往下算第二對(duì)稱葉即接種二葉片，
接種株置于 2 1 及 2 6℃ (恆溫)，并于接種后第一天 ( 2 4 小
時(shí))、第二天 ( 4 8 小時(shí))及第三天 ( 7 2 小時(shí))分別採(cǎi)取接種葉
片、根及莖，以 L N V 兔子抗血清利用 indirect ELISA 及
D T B 進(jìn)行分析比較其偵測(cè)效力。試驗(yàn)重覆三次，每次每
一處理接種六株植齡相彷之植株，每日取樣二株，其中之
二接種葉片 (每株一葉片) 供 indirect ELISA 分析，另二葉
片供為 D T B 分析。另以蒸餾水接種三株做為對(duì)照處理。