顯微鏡,金相顯微鏡,生物顯微鏡,北京地區(qū)專業(yè)供應(yīng)商

點擊查看產(chǎn)品參數(shù)和報價--丨--

正文:

冷凍切片法

前準備器材及消耗品
冷凍切片機
subbing 載玻片
冷凍包埋劑 (cryo tissue embedding compound)
明視野顯微鏡
解剖顯微鏡
 
解剖顯微鏡生物標本之物理脫水及化學(xué)急速脫水法

物理脫水法：
    已固定之標本經(jīng)洗滌后將固定液洗除后即可進行脫水及包埋于石臘或塑料中。脫水之步驟是以脫水劑如乙醇或丙酮由低濃度漸進至高濃度以物理取代之方式將組織中的水置換出來，使標本最終達到無水之狀態(tài)。由于脫水劑系有機之藥品且組織內(nèi)外急劇的濃度改變，產(chǎn)生物理性之壓差易造成組織形態(tài)上的改變，因此起始之脫水濃度及每一步驟之濃度差，需參考材料之軟硬程度或組織是否為分生組織等纖細之性質(zhì)。一般而言較細嫩的材料，如作細胞觀察或電子顯微鏡標本之制備，須由較低濃度開始脫水如10％，且每一步驟之濃度差距須較小如10-20％。而較硬的成熟組織或作一般組織觀察之目的，則可由較高濃度開始脫水如30％，且每一步驟之濃度差距可較大如20-30％。此外，起始脫水濃度和固定液的使用濃度需相近。常用的酒精脫水系列之濃度為10％－30％－50％－70％－85％－95％－100％，每一步驟之脫水時間可視材料大小而異，小材料如細胞或根尖，可以30分鐘-1小時為一級距，大材料塊則以4-8小時為一級距。有些材料經(jīng)脫水后呈透明無色狀，可于脫水過程中加入erythrosin或toludine blue同時進行表面之染色，使材料經(jīng)包埋后易于辨認其外形或上下方向。染料于何時加入進行染色，則視其最佳溶解度，需與溶劑的濃度相配合，如toludine blue則適合于純TBA時加入少許進行染色。材料經(jīng)包埋切片后黏貼于載玻片上，其脫水之情形大致同上述。
上述的物理脫水法過程繁復(fù)費時且總程時間冗長，但效果穩(wěn)定可靠分別為其缺點與優(yōu)點。
化學(xué)脫水法：
另一種原理完全迥異的脫水法稱為化學(xué)急速脫水法（Lin et al. 1977）。它是基于化學(xué)反應(yīng)之原理，A＋B     C＋D若Ａ代表組織中所含的水，B是脫水劑，經(jīng)反應(yīng)后生成不同的化學(xué)產(chǎn)物C和D，于是組織中的水于瞬間完全消失而達到脫水的目的。反應(yīng)中使用的脫水劑可以是雙甲氧基丙烷2,2-dimethoxypropane（DMP）或雙乙氧基丙烷2,2-diethoxypropane（DEP）。進行下式之反應(yīng)
    CH3                                      O
          ∣                                       ∥
H3CO－C－OCH3  ＋  H2O      2 CH3OH  ＋CH3－C－CH3
          ∣
          CH3 
               
        2,2-DMP＋H2O                methanol  ＋  Acetone
此反應(yīng)所用之DMP需經(jīng)酸予以酸化，進行此步驟可于25 ml之DMP中加入3滴（每滴約0.06 ml）之0.1 N HCl即足夠，若過度的酸化，將使脫水之組織其蛋白分子上羧基之H離子被生成物甲醇之甲基取代而形成所謂之甲基化，經(jīng)甲基化之組織將失去蛋白分子被染料分子染色的性質(zhì)，而形成負染之現(xiàn)象，應(yīng)予避免，除了上述避免過度酸化外亦可將脫水步驟快速重復(fù)三次（每次5分鐘），如此即可將生成物移去，而排除形成甲基化之機會。
    由于化學(xué)脫水之產(chǎn)物甲醇及丙酮，均為物理脫水之最終目的產(chǎn)物，因此理論上脫水過程系于瞬間完成，且水一碰上脫水劑之瞬間就完成反應(yīng)，因此物理脫水過程中，因濃度差異所造成之物理壓差并不存在，皆為此方法之優(yōu)點。
化學(xué)急速脫水之簡略參考流程如下：
2％glutaraldehyde固定液，以0.1 M cacodylate緩沖液pH 7.4配制
在4℃固定1小時
↓
以0.1 M cacodylate緩沖液淋洗3次，每次5分鐘
↓
以2％OSO4之水溶液進行后固定1小時
↓
以二次蒸餾水淋洗3次，每次5分鐘
↓
以酸化的DMP脫水，15分鐘內(nèi)更換3次新配的DMP
↓
（以100％之丙酮取代DMP）
↓                                   ↓                  ↓
塑料包埋                          石臘包埋         臨界點干燥
↓                                   ↓                  ↓
超薄切片       2 切片              8－30切片         鍍金
↓              ↓                   ↓                  ↓
鈾及鉛染色  Toludine Blue染色   Safranin, Fast Green染色 SEM觀察
↓              ↓                   ↓
TEM觀察       LM觀察             LM觀察