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植物病毒檢測技術(shù)介紹,植物病毒血清與分子檢測技術(shù),金相顯微鏡專家！

　　為生產(chǎn)符合規(guī)定的健康種苗，須先行親本的病毒檢測，確定無病毒后，才能進行組織培養(yǎng)，并進入大量繁殖的階段，因此，病毒檢測技術(shù)實為作物邁向健康種苗產(chǎn)業(yè)之重要關(guān)鍵。植物病毒檢測診斷技術(shù)包括：病徵診斷法、生物檢定法、病毒內(nèi)含體診斷技術(shù)、電子顯微鏡技術(shù)、血清檢定法與核酸檢測技術(shù)，其中病徵診斷法與內(nèi)含體觀察須由經(jīng)驗豐富者判斷，且部分植物病毒病害的病徵與微量元素缺乏引起的病徵相似，易致誤判；生物檢定法雖然成本低廉，但是須有隔離溫（網(wǎng)）室及 7 ~ 10 天觀察期；電子顯微鏡不但造價昂貴且須專人操作，恐怕無法應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)界，目前仍以學(xué)術(shù)性觀察病毒顆粒之研究為主。

　　鑒于植物病毒顆粒結(jié)構(gòu)主要以外部的鞘蛋白及內(nèi)部的核酸為主，因此植物病毒檢測技術(shù)可分為 2 個主流：一為針對鞘蛋白的抗血清檢定技術(shù)，以酵素連結(jié)抗體吸附反應(yīng)（ Enzyme-linked immunosobent assay, 簡稱 ELISA ）為主；另一則針對內(nèi)部核酸物質(zhì)的核酸檢測技術(shù)，以反轉(zhuǎn)錄核酸聚合脢連鎖反應(yīng)（ Reverse transcription- PCR ， 簡稱 RT-PCR ）為主。近年，隨著動植物疫病快速檢測診斷之需求，學(xué)者更將分子生物學(xué)、酵素動力學(xué)、電子學(xué)、光學(xué)與訊號處理等技術(shù)結(jié)合成生物晶片 (Biochip) ，應(yīng)用于植物病毒的檢測。以下針對 ELISA 、 RT-PCR 及生物晶片等植物病毒檢測技術(shù)加以介紹：

一 . ELISA

　　此技術(shù)係利用抗體與抗原的專一性結(jié)合，經(jīng)由標(biāo)定于抗體上酵素之作用，將檢測結(jié)果以顏色變化呈現(xiàn)，輔以儀器讀取其吸光度數(shù)據(jù)，俾憑判斷正負反應(yīng)。因其抗體抗原結(jié)合順序差異或酵素連接抗體與抗原的直接與間接性，又可分為直接法與間接法，目前以間接法應(yīng)用較廣。此技術(shù)不僅具有快速、專一、方便及經(jīng)濟等特性，更適用于大量樣品之病毒檢測，加上結(jié)果之再現(xiàn)性與穩(wěn)定性均深獲各界肯定，因此，此技術(shù)已被種苗業(yè)界廣泛使用。

二 . RT-PCR

　　核酸檢測法係建立于物種間獨特的核酸序列，然后依此序列設(shè)計出該物種人工合成的短片段專一性核酸引子對，再配合核酸聚合酵素連鎖反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction, 簡稱 PCR) 技術(shù)，此技術(shù)乃利用一種分離自細菌的耐高溫核酸複製酵素，在適宜的變溫循環(huán)程式下，針對目標(biāo)病毒的特定區(qū)域核酸進行快速複製，約經(jīng) 2 小時 30 個循環(huán)左右，即可複製出約 2 30 （約 10 億）倍的核酸，再經(jīng)由電泳分析以肉眼判別所增幅的核酸條帶。植物病毒核酸大多屬于 RNA ，故在變溫循環(huán)前，須先以病毒反轉(zhuǎn)錄酵素（ reverse transcription ）進行 RT-PCR ，將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 DNA 分子。

　　由于基因體核酸乃各種病毒蛋白前驅(qū)物，而 PCR 係針對病毒核酸分子進行檢測，因此理論上比 ELISA 技術(shù)更敏感，可更早偵測到病毒的存在。