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正文:

微囊蟲病

一級初步診斷：
從發(fā)病牡體之內(nèi)收肌，觸鬚及外套膜，特別從綠色膿皰病灶，行涂抹染色檢查，染色液可使用Wright、Wright-Giemsa或相當(dāng)染色液如Haemacolor、Diff Quick，于檢下可見蟲體呈現(xiàn)嗜鹼性細(xì)胞質(zhì)、嗜酸性細(xì)胞核，外形似小球狀或卵圓形，具有二核融合細(xì)胞蟲體（2至4μm寬），寄生或游離于泡狀細(xì)胞，有時寄生于血淋球內(nèi)。
二級初步診斷：目前尚無培養(yǎng)此蟲體的方法。
三級初步診斷：
由組織病理學(xué)鏡下觀察，從罹病牡體之泡狀結(jié)締組織細(xì)胞內(nèi)可見2至3μm大小之寄生蟲體，亦可于肌細(xì)胞或血淋球內(nèi)觀察到病原；而魯夫來微囊蟲（M. roughleyi奧洲冬季死亡癥之病原，一般本病原為養(yǎng)殖雪梨牡犡（Saccostrea. commercialis）造成區(qū)別之重點(diǎn)，在于魯夫來微囊蟲所感染寄生的宿主細(xì)胞質(zhì)會于週邊，并取代細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生空泡，稱為細(xì)胞質(zhì)性空泡（cytoplasmic vacuole），而其他波納米亞蟲（Bonamia spp.）與本病原無此變化特徵,同時魯夫來微囊蟲每個感染階段都寄生于血淋球內(nèi)，而本病原通常出現(xiàn)于損傷組織部位四週之空泡性結(jié)締組織細(xì)胞內(nèi)，見附表一。
一級確定診斷：
于罹病牡蠣體壁、內(nèi)收肌、外套膜及唇鬚表面可見黃綠色5mm直徑之膿皰，且常在外套膜表面之膿瘍">膿瘍病灶附近貝殼上留下棕色斑痕（brown scar）。
二級確定診斷：目前并無發(fā)現(xiàn)本病原具有特異性血清型。
三級確定診斷：
1.穿透式電子顯微鏡下檢查，予波納米亞蟲之區(qū)別在于本病原核仁位于細(xì)胞核中央，并缺之粒線體及單孢子體之構(gòu)造，而B. ostrea核仁呈偏側(cè)位置（eccentric location）；至于本病原在電子顯微鏡下各種蟲體形之變異，Hine et al，于2001年（R），有詳細(xì)的報導(dǎo)，本文前述已有介紹，本病原三個蟲體型的變異，可在泡狀結(jié)締組織細(xì)胞及血淋球內(nèi)發(fā)現(xiàn)，本病原為細(xì)胞內(nèi)絶對寄生性原蟲，觀察出蟲體非常接近宿主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)之粒綫體，此目的主要是獲居宿主細(xì)胞的能量來源。
2.使用聚合酶連鎖反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）從SSU rDNA區(qū)域分析，并設(shè)計出一組專一性之primers 5′-AGA-TGG-TTA-AGC-CTC-C-3′及5′-GCG-AGC-TGC-CAC-AAG-GC-3′估計放大之產(chǎn)物為546bp片段。在操作過程中，經(jīng)淬取病原DNA后，加入各種反應(yīng)物，并由最初變性（denaturation）94℃，10 分鐘40循環(huán)、94℃、1分鐘，60.5℃、1分鐘，及72℃、1分鐘，最后之?dāng)U展72℃、10分鐘，其產(chǎn)物經(jīng)1.5% agarose gal電泳，再由UV光檢測產(chǎn)物；詳細(xì)步驟可參閱世界動物衛(wèi)生組織水生動物檢驗(yàn)手冊（Manual of diagnostic for aquatic animals, 2006）第2.2.5章infectrin with Mikrocytos mackini之內(nèi)容。
3.FISH及ISH
螢光原位雜交法（fluorescent in situ hybridization, FISH）之檢驗(yàn)步驟設(shè)計，係使用4個oregon green標(biāo)示于寡核苷酸探針上（oligonucleotide probes），其探針序列為Mackini-1-OG：AGC-CCA-CAG-CCT-TCA-C， Mackini-2-OG：CCG-CCC-TTC-TCA-
GGT-C； Mackini-3-OG：CGA-AAG-TGG-TAG-CTA-AAG；Mackini-4-OG：AGT-AGC-
CTG-CTT-CCA-CT再統(tǒng)各種操作程序，可參考Carnegie et al. 2003(R)，發(fā)表之文獻(xiàn)。
原位雜交法（in situ hydridization, ISH），係經(jīng)digoxignin標(biāo)示探針Mackini-1-OG:
5′-AGC-CCA-CAG-CCT-TCA-C-3′-DIG上（Meyer et al. 2005,R），有效成功具專一性及敏感性的檢出本病原于消化腺、鰓、心臟、腎及腸管等組織。
4.定序（sequencing）
將PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA定序后，再與基因庫中編碼AF477623比較對照其親族關(guān)係，始可確診本病原。在世界動物衛(wèi)生組織（OIE）中規(guī)定要確診本病原需經(jīng)組織病理學(xué)（histopathology），抹片檢查（imprints），PCR及ISH、DNA定序及穿透式電子顯微鏡檢查均為陽性反應(yīng)后，才能最后確診。