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安非他命對NMDA在大白鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞上所引起45Ca2+蓄積之作用

在大白鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞培養(yǎng)中發(fā)生的細胞凋零的特征

1)安非他命是一種精神刺激劑，有關安非他命的中樞神經(jīng)作用的研究過去大都著重在與多巴胺神經(jīng)傳導系統(tǒng)的關系，然而最近有許多證據(jù)顯示安非他命所造成的行為敏感化作用 (behavior sensitization) 能被N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA) 的拮抗劑所阻斷， NMDA受體的活化參與了安非他命的中樞神經(jīng)的作用。過去本實驗室利用[3H]TCP受體結(jié)合的方法及45Ca2+ accumulation的實驗，觀察安非他命對NMDA受體的作用，結(jié)果顯示安非他命可以直接抑制NMDA受體的活化。在本實驗中我們將再次確認安非他命可以抑制NMDA所引起的45Ca2+ accumulation，并且比較右旋 (d-amphetamine)、左旋安非他命 (l-amphetamine)及甲基安非他命(Methamphetamine)對NMDA所引起的45Ca++ accumulation是否具有抑制作用及其個別的強度。

結(jié)果顯示，安非他命是NMDA的拮抗劑且安非他命對NMDA引起的45Ca2+ accumulation有兩階段的抑制作用。而不同結(jié)構的安非他命對NMDA引起的45Ca2+ accumulation的抑制作用強度是差不多的。

(2) Apoptosis (細胞凋亡)又稱為Programmed cell death (計劃性細胞死亡)，顧名思義，它是由細胞自行調(diào)控死亡，是一種選擇性的主動死亡方式。本實驗利用大白鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞的培養(yǎng)觀察apoptosis的現(xiàn)象，我們發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，神經(jīng)細胞的密度漸漸降低而且有許多細胞呈現(xiàn)apoptosis的特征包括神經(jīng)細胞縮小、核質(zhì)濃縮、及產(chǎn)生許多apoptotic bodies等。因此我們判定這種神經(jīng)細胞培養(yǎng)有自生性的apoptosis，根據(jù)此種觀察，我們想要利用其它重要方法來確定此種判斷。我們除了利用倒立式相位差顯微鏡直接觀察并照下神經(jīng)細胞的外型之外，并且以LDH response測量細胞毒性，及利用TUNEL assay 偵測apoptosis的細胞，以及利用RT-PCR的方法偵測一些mRNA的表現(xiàn)量，包括bax、c-fos、c-jun等。此外，我們并分別在神經(jīng)細胞離體外培養(yǎng)第6、12、18天時投與NMDA、MK-801、morphine、naloxone等藥物觀察它們對神經(jīng)細胞的影響，瞭解他們是否會促進或抑制神經(jīng)細胞的apoptosis。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)大白鼠大腦皮質(zhì)初代神經(jīng)細胞培養(yǎng) (rat primary neuronal cell culture)中有自發(fā)性的apoptosis，可作為一種研究apoptosis的模式。而且直接以顯微鏡及以TUNEL assay觀察都發(fā)現(xiàn)：apoptosis細胞的數(shù)目會隨著培養(yǎng)天數(shù)增加而上升。再偵測培養(yǎng)1到22天的細胞的mRNA，以ß-actin作為internal control，發(fā)現(xiàn)c-fos mRNA的量在第20天有明顯的上升，但是NSE、NF-M、bax、c-jun mRNA在不同天數(shù)則沒有明顯差異。在第6天的culture上不論NMDA、MK-801、morphine、naloxone對細胞內(nèi)LDH釋放的量都沒有明顯的作用，細胞型態(tài)在不同時間也沒有明顯變化，但是投與NMDA與MK-801會降低c-fos mRNA的量。在第12、18的細胞投與NMDA與MK-801則會降低NSE和NF-M mRNA的量。在第12天、18天的culture上NMDA組的LDH值比control組高，在倒立式相位差顯微鏡下觀察到NMDA組細胞外型呈現(xiàn)明顯的necrosis，到24小時細胞已明顯的死亡(Figure 27,29)，此時以TUNEL assay偵測apoptosis的細胞，發(fā)現(xiàn)neuron的數(shù)目較少，而且存活下來的細胞也幾乎100%發(fā)生apoptosis�？梢姷肗MDA會同時造成neuron的necrosis與apoptosis。