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細胞內(nèi)胞器或蛋白質(zhì)分布,免疫染色,顯微鏡與基因轉(zhuǎn)染技術(shù)!

在細胞繼代培養(yǎng)中，我們使用37度水浴預熱培養(yǎng)液及Trypsin溶液，是為了達到恒溫動物的體溫范圍，為細胞適應的正常溫度。培養(yǎng)液中的成分有胎牛血清作為養(yǎng)分來源、抗生素以及胺基酸。Trypsin溶液為可破壞細胞黏著性的物質(zhì)，故其可使細胞脫離培養(yǎng)基底，而血清中含有破壞Trypsin的物質(zhì)，所以當加入含10 % 胎牛血清之DMEM培養(yǎng)液時可終止Trypsin的作用

運用了抗體與抗原高度專一結(jié)合的特性，進行免疫染色法。抗原為能刺激淋巴細胞產(chǎn)生抗體的異己蛋白質(zhì)；抗體分單株抗體和多株抗體，單株抗體是由已經(jīng)建立的融合瘤細胞所產(chǎn)生的而多株抗體為動物生產(chǎn)的傳統(tǒng)抗血清。免疫染色法即先使用一級抗體辨識已知會位在特定胞器的抗原，再使用具有螢光標定的抗一級抗體的二級抗體，辨識一級抗體及抗原的所在位置，由此得知胞器的所在。之所以使用二級抗體，是使其將一級抗體的訊號放大，再使用螢光標定其位置。

還運用了基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）的方法，將VSVG-GFP以及ARL1QL的質(zhì)體送入細胞中。而基因轉(zhuǎn)殖根據(jù)不同的運送模式可分為三種：物理性方法、化學性方法和重組病毒感染法。較常用的方法有物理性的電穿孔法、化學性以DNA-磷酸鈣顆粒經(jīng)胞飲作用進入細胞以及我們本次實驗的以脂質(zhì)體媒介包埋。以脂小體為載體將DNA轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)的方式，其主要機制雖不全然清楚，但知DNA帶負電之磷酸根會與脂小體表面之正電荷結(jié)合，脂小體帶正電荷的部分又會與細胞表面帶負電荷的分子結(jié)合藉以進行轉(zhuǎn)染。另外，實驗過程中，我們曾有脂小體造成細胞死亡的經(jīng)驗，由此得知脂小體對細胞有傷害性。而事實上，只要細胞接受了轉(zhuǎn)染作用，不管是用哪種轉(zhuǎn)染法，對細胞的毒殺性是普便存在的。市面上各種不同的脂小體主要的差異是在它們脂質(zhì)的成分、比例，而這些脂質(zhì)有許多都是因為要增加轉(zhuǎn)染的成功率，所特地制造出來的化學成分，亦即它們對細胞膜而言不是天然的組成，所以推測脂小體對細胞的毒殺性是因為這些外生性的脂質(zhì)所造成的。

實驗觀察中，我們運用了特定的抗原必然和特定的抗體相結(jié)合這一個事實，使帶螢光標記的抗體和胞器中的抗原進行抗原抗體反應，這樣兩者的結(jié)合體就能透過抗體的螢光觀察到。而利用螢光蛋白或具有螢光標定的抗體標示蛋白質(zhì)的原理為，當螢光物質(zhì)（螢光染劑）受到較短波長的光及足夠的能量所激發(fā)，當要回到穩(wěn)態(tài)的能階時，會釋出較長波長的螢光，如：來自水母的綠色螢光蛋白基因，其激發(fā)光譜約為488nm，釋放光譜約為507nm。

結(jié)論

（一）透過該次的實驗，讓我們得知要了解細胞內(nèi)胞器或蛋白質(zhì)的分布，免疫染色、顯微鏡與基因轉(zhuǎn)染的技術(shù)是相當重要的。

（二）觀察運輸系統(tǒng)的存在。CTB-594是一種細菌毒蛋白質(zhì)，會經(jīng)內(nèi)胞作用而運送至高基氏體；Tf-488 nm是一種運鐵蛋白質(zhì)，也會經(jīng)內(nèi)胞作用而運送至高基氏體；而VSVG-GFP是在細胞內(nèi)合成后，會經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運送至高基氏體，再運送至細胞膜。

（三）證明ARL1分子會調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的運輸作用。因為大量表現(xiàn)其突變株（ARL1QL），造成VSVG-GFP無法順利送至細胞膜上，而堆積在高基氏體。


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