標(biāo)題：顯微鏡下細(xì)胞黏菌形態(tài)觀察步驟-專業(yè)制造金相顯微鏡
信息分類:站內(nèi)新聞
作者:yiyi發(fā)布
時(shí)間:2012-11-13 23:05:58
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正文:
顯微鏡下細(xì)胞黏菌形態(tài)觀察步驟
〈1〉生活史的觀察
〈2〉 孢子與孢子囊柄細(xì)胞的觀察
利用滅菌后的解剖針挑起一株孢子囊體于載玻片上，加一滴水蓋上蓋玻片，以光
學(xué)顯微鏡觀察，使用顯微測(cè)量尺測(cè)孢子大小、極粒的有無(wú)和孢子囊柄頂端形態(tài)及基部寬度與相關(guān)圖鑑做對(duì)照，以辨別其種類
※每一形態(tài)特征取約20個(gè)測(cè)量，均逢機(jī)選取，再求出大小范圍、平均值及標(biāo)準(zhǔn)差
抽取DNA
1. 取一tube(微量離心管)并加入50μl ddH2O(經(jīng)過(guò)二次滅菌過(guò)的純水)
2. 探針尖端以酒精高熱消毒，從培養(yǎng)皿挑入50~100個(gè)細(xì)胞黏菌的孢子囊堆(sorus)
3. 加入sea sand(海砂)適量，以研磨棒研磨數(shù)次
4. 加入500μl預(yù)熱65℃之2﹪CTAB buffer (1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM EDTA, 2% PVP-40【w/v】, 20 mM cetyl trimethyl ammonium bromide【CTAB】；and 0.5% 2-mercaptoethanol【v/v】)，略研磨以混合之
5. 加入3μl 2-mercaptoethand(hood)，置于65℃水浴槽水浴十分鐘以破壞細(xì)胞壁
6. 加入500μl dichlormethane : isoamyl alcohol(24:1)(hood)，以紙巾覆蓋震盪
7. 室溫下離心13000rpm 7mins，抽取上清液于新tube
8. 加入300μl isopropanol(hood)，以紙巾覆蓋震盪，室溫下離心13000rpm 7mins以沉淀DNA
9. 去除上清液，加入500μl wash buffer(76% ethanol, 10 mM ammonium acatate)去除鹽類物質(zhì)靜置二分鐘
10. 室溫下離心13000rpm 7mins，去除上清液并倒置烘乾
11.加入30μl ddH2O，放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘
※完成后最好直接進(jìn)行聚合酶連鎖反應(yīng)，否則需要冷藏保存
（一）聚合酶連鎖反應(yīng) (Polymerase chain reaction，PCR)轉(zhuǎn)錄ITS1區(qū)域步驟
1. 取一新tube依序加入下表溶液(單位μl)：
2. 各取45μl加入每個(gè)抽好DNA的tube(不能有氣泡)
3. 置于聚合酶反應(yīng)器進(jìn)行40循環(huán) ※保存需冷凍
（二）PCR產(chǎn)物檢測(cè)(電泳)
1. 取一塊用ethidium bromide染色的2﹪洋菜膠連同膠盤置入電泳槽，注入1x TBE buffer直到液面略淹過(guò)洋菜膠
2. 取一張乾淨(jìng)的parafilm，滴2μl DNA loading dye及2μl DNA marker混合后滴入洋菜膠第一格樣品槽作為標(biāo)記，藉不同大小的DNA分子相異的位移鑑定產(chǎn)物大小
3. 混合 2μl DNA loading dye及5μl PCR產(chǎn)物分別滴入樣品槽
4. 進(jìn)行電泳約25分鐘，取出膠片置于紫外線透視觀察箱下拍照紀(jì)錄
（三）DNA定序
將所得的PCR產(chǎn)物采用自動(dòng)定序分析儀(ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer、ABI 3730 DNA Analyzer , USA)，以定序套組(ABI PRISM BigDyeTM Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)進(jìn)行PCR反應(yīng)，來(lái)進(jìn)行菌株的定序
出自http://www.bjsgyq.com/北京顯微鏡百科
特別聲明：本文出自北京上光儀器有限公司-未經(jīng)允許請(qǐng)勿轉(zhuǎn)載，本文地址：http://www.bjsgyq.com/news/3617.html
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