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基因載體轉(zhuǎn)殖 (Vector Transfection)

目的：將含特定基因的DNA載體送入哺乳動物細胞中，以表達特定蛋白質(zhì)。

原理：目前將DNA送入真核細胞有Calcium phosphate處理法、Polybrene處理法、DEAE-
dextran處理法、Electroporation處理法、Protoplast fusion法、Liposome處理法以及直
接將DNA注入細胞核內(nèi)的顯微注射法 (Direct microinjection into nuclei)。Liposome是
人工合成之胞膜，被研發(fā)當作活體或離體試驗的運送載體。應用原理是將DNA或
RNA包于Liposome中，由Liposome與細胞膜融合將DNA或RNA送入細胞內(nèi)。

儀器用具：二氧化碳水套式培養(yǎng)箱、倒立式螢光顯微鏡、無菌操作臺、四孔細胞培養(yǎng)皿、無
菌定量吸管。

藥品試劑：小鼠胚胎細胞株NIH/3T3、無血清無抗生素細胞培養(yǎng)液、完全培養(yǎng)液、含綠螢
光蛋白GFP (Green Fluorescence Protein)基因的DNA載體、轉(zhuǎn)殖試劑lipofectamine
2000。

步驟：
1. 將NIH/3T3以0.5 ml無抗生素細胞培養(yǎng)液, 0.5–2 × 105個細胞/孔的密度植入四孔培養(yǎng)
皿中，培養(yǎng)24小時。
2. 對每一孔細胞轉(zhuǎn)殖實驗，以50 µl無血清無抗生素培養(yǎng)液稀釋溷合0.8 µg欲轉(zhuǎn)殖的
DNA質(zhì)體。
3. 對每一孔細胞轉(zhuǎn)殖實驗，以50 µl無血清無抗生素細胞培養(yǎng)液稀釋溷合2 µl轉(zhuǎn)殖試劑
lipofectamine 2000后，靜置于室溫下5分鐘。。
4. 將前述兩項DNA與轉(zhuǎn)殖試劑lipofectamine 2000稀釋液溷合靜置于室溫下20分鐘。
5. 對每一孔細胞轉(zhuǎn)殖實驗，將100 µl的前項DNA與lipofectamine 2000溷合液加入四孔
培養(yǎng)皿中的一孔。前后搖動培養(yǎng)皿后，再放回二氧化碳水套式培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6. 培養(yǎng)4–6小時，可吸出轉(zhuǎn)殖溷合液，換上新的完整細胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培
養(yǎng)14–44小時，即可以倒立式螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白表達之情形。

四孔細胞培養(yǎng)皿

倒立式螢光顯微鏡

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