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梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲檢測方法 －過濾濃縮 / 免疫磁性抗體分離 / 免疫熒光抗體分析法

一、方法概要　　本方法應(yīng)用于水中梨形鞭毛蟲（Giardia）及隱孢子蟲（Cryptosporidium）之定性與定量檢測。用過濾方式將 10 ～ 20 公升水樣中之梨形鞭毛蟲與隱孢子蟲收集于濾管上。以流洗液沖洗之后離心，經(jīng)磁性抗體分離純化，所得之蟲體再以熒光標(biāo)記之單株抗體及4’,6 - diamidino - 2 - phenylindole（DAPI）染色，在具有微分干涉差（Differential Interference Contrast, DIC）的熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。鏡檢作定量計(jì)數(shù)時(shí)必須就蟲體之形狀、大小、顏色與熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)品作比對。

二、適用范圍　　本方法適用于地表水、地下水、飲用水、水源水質(zhì)等水樣中梨形鞭毛蟲及隱孢子蟲之檢測。但不適用于高濁度及含干擾物質(zhì)水樣之檢測。
三、干擾
（一）無機(jī)物及有機(jī)物分解造成之碎片會在過濾、分離及鏡檢時(shí)造成各種程度的干擾；黏土?xí)�影響鏡檢之觀察；凈水處理系統(tǒng)中添加的化學(xué)物質(zhì)如鐵鋁等混凝劑及高分子物質(zhì)也會造成干擾。
（二）藻類及酵母菌所產(chǎn)生的非特異自發(fā)性熒光常會在熒光顯微鏡的觀察時(shí)造成偽陽性的誤判。
（三）溶液、試劑、玻璃容器及其它采樣過程中可能因人為操作之失誤而在鏡檢觀察時(shí)造成誤判，因此在實(shí)驗(yàn)流程必須同時(shí)進(jìn)行一組方法空白即負(fù)控制組（Negative control sample）以作為比對。檢驗(yàn)中如有更換試劑水或檢測試劑時(shí)，亦應(yīng)考慮進(jìn)行空白組試驗(yàn)。
（四）在樣品分離過濾的過程中有些藻類、細(xì)菌及原生動物會伴隨著目的原蟲同時(shí)被分離出來，造成鏡檢觀察計(jì)數(shù)之干擾。
（五）水樣、濾管、流洗液、離心濃縮及玻片可能含有影響卵囊及休眠體鑒別之因子，因此必須進(jìn)行背景負(fù)控制組。

四、設(shè)備及材料
（一）10 至 15 公升的水桶，在 10.0、15.0 公升之處應(yīng)有刻度。
（二）攪拌棒：不銹鋼或塑料制，可作為水樣攪拌用者。
（三）血球計(jì)數(shù)器及蓋玻片：可作為原蟲計(jì)數(shù)用者。
（四）拭鏡紙：不含硅質(zhì)者。
（五）PP 或 PE 材質(zhì)之塑料平底螺旋試管，5 ～ 50 mL。
（六）濾管：商品名為 Envirochek 或其同級品，材質(zhì)為 polyethersulfone。直徑約 6 公分，長 21 公分，孔徑為 1.0 μm，大約為 1300 平方公分的過濾面積。
（七）懸臂式震蕩器：含有側(cè)棒可以固定濾管，作為濾管中原蟲之震蕩分離者。
（八）采樣器連接管：玻璃、PTFE 或 HDPE 材質(zhì)，不易使原蟲附著其上者。
（九）流量計(jì)及流量計(jì)流量控制閥：0.5 gpm 或每秒流速可控制在 0.3 公升者�；蚋接忻棵� 0.4 ～ 4 公升的流速附控制閥者。
（十）抽氣馬達(dá)：1 / 4～1 / 2 HP 均可。
（十一）磁性抗體樣品混合磁座（MPC - 1、 MPC - M Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）：可作為免疫磁性抗體套組IMS混合之用。（十二）磁珠濃縮用試管 ：10 mL 之玻璃試管。（Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）
（十三）磁珠濃縮用離心試管：容量約為 10 mL 之塑料離心管。（Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）
（十四）磁珠解離用側(cè)邊扁平試管：6 × 125 mm，側(cè)邊 60 × 10 mm。（Dynal 公司產(chǎn)品或其同級品）
（十五）乳膠手套。（十六）量筒：10、100 及 1000 mL 可高壓滅菌之量筒。
（十七）離心機(jī)：懸臂式、可以容納 15 至 250 mL 圓錐底離心管。
（十八）離心管：圓錐底、有刻度、容量 1.5、50 及 250 mL。

（十九）顯微鏡：熒光顯微鏡，含 DIC 裝置。20 倍（N.A. ＝ 0.4）至 100 倍（N.A. ＝ 1.3）放大倍率。DAPI 之激發(fā)波長：340 至 380 nm。
（二十）吸管：使用 5、10、25 mL 之無菌吸管、玻璃或塑料制。
（二十一）天平：分析天平，可以精稱至 0.1 mg 者�！　　∩厦筇炱�，可以精稱至 10 mg 者。
（二十二）pH 測定計(jì)。（二十三）恒溫培養(yǎng)箱。（二十四）試管振蕩器。
（二十五）抽氣幫浦：可以維持在 25 in.Hg 以上者具有逆止閥及真空度量測計(jì)者。

五、試劑
（一）NaOH：試藥級，6.0 及 1.0 N 及 0.1 N。
（二）HCl：試藥級，6.0、1.0 及 0.1 N。
（三）溶劑：丙酮、甘油、乙醇及甲醇，均為試藥級。
（四）試劑水：不含磁性物質(zhì)者。
（五）磷酸緩沖溶液（PBS）：溶解 1 .07 g 的 Na2HPO4，0.39 g 的 NaH2PO4和 8.5 g 的 NaCl 至 800 mL 的稀釋水中，再加至總量為 1000 mL。調(diào)整 pH 為 7.2，保存于 4 ℃ 冰箱中，期限為一星期。
（六）Laureth 12 溶液：稱取 10 g 的 Laureth 12（PG 公司 06194 或同級品）加入 90 mL 的試劑水中，以加熱板或微波爐加熱溶解。分裝 10 mL 至無菌小瓶中 ，室溫下可儲存 2 個(gè)月，4 ℃ 冰箱內(nèi)可保存一年以上。
（七）1 M Tris 溶液：稱取 121.1 g 的 Tris 溶于 700 mL 的試劑水中，以 1 N 的 HCl 或 NaOH 調(diào)整至 pH 為7.4。再加試劑水至總量為 1000 mL， 再調(diào)整 pH 至上述值。再以 0.22 μm 濾膜無菌過濾，于無菌塑料瓶，室溫保存以二個(gè)月為限。
（八）0.5 M EDTA 溶液：稱取 186.1 g 的 EDTA 溶于 800 mL 的試劑水中，以 6.0 N 的 NaOH 或 HCl 調(diào)整 pH 至 8.0，再加試劑水至 1000 mL，再以 1.0 N 的 NaOH 或 HCl 調(diào)整 pH 至上述值。4 ℃ 冰箱中保存期限為二個(gè)月。
（九）消泡劑 A：Sigma 公司 A5758，或同級品。
（十）流洗緩沖液：將（六）Laureth 12 溶液以試劑水稀釋 100 倍，即 10 mL 的原液加 10 mL 的 Tris 、2 mL 的 EDTA 及 150 μL的消泡劑稀釋至總量為 1000 mL。
（十一）IMS 免疫磁性抗體套組：Dynal 公司產(chǎn)品，含梨形鞭毛蟲抗體磁珠、隱孢子蟲抗體磁珠、SL 緩沖液 - A、SL 緩沖液 - B（十二）DABCO / 甘油鏡檢固定液：溶解 2.0 g 的 1,4 - diazabicycle [2.2.2]octane（DABCO, Sigma ＃D - 2522）于 95 mL 的加熱的甘油 / PBS 溶液（60 ％ 的甘油，40 ％ 的 PBS），用磁石攪拌直至 DABCO 完全溶解，再加甘油 / PBS 溶液至 100 mL。保存期限為 6 個(gè)月。DABCO 加熱時(shí)會產(chǎn)生有毒蒸汽，預(yù)避免吸入或與皮膚、眼晴接觸。
（十三）隱孢子蟲 / 梨形鞭毛蟲免疫抗體檢測標(biāo)記套組：Meridian 公司產(chǎn)品（品號 250050 或同級產(chǎn)品，含對比染液counterstain、檢測試劑 detection reagent 及洗劑 wash buffer）。儲存于 0 至 8 ℃，不能冰涷，使用前回復(fù)至室溫，本產(chǎn)品須避光保存，試劑稀釋之后保存期限為 48 小時(shí)。
（十四）DAPI（4’6’ - diamidino - 2 - phenylindole）染劑：　 儲備液：溶解 2 mL 的 DAPI 于 100 ％ 甲醇中，避光保存于 0 至 8 ℃ 的冰箱，保存期限為 2 星期�！� 染液：以 PBS 稀釋 5000 倍，即取 10 μL 的儲備液， 以 50 mL 的 PBS 稀釋，使用前配制不得過夜使用。
（十五）卵囊體及休眠孢子標(biāo)準(zhǔn)添加液：具活性的的隱孢子蟲及梨形鞭毛蟲可以用加熱 75 ℃ 以上一分鐘或 37 ﹪ 福爾馬林使之失去活性。
（十六）0.01 ％ Tween - 20 溶液：量取 1 mL 的 10 ％ Tween - 20 于 1 L 的試劑水中。

六、采樣與保存
（一）水樣現(xiàn)埸過濾或以 10 ～ 20 公升的塑料桶采集，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行過濾濃縮分離等步驟。樣品運(yùn)送及保存應(yīng)保持在0至8℃。但不得冰凍。
（二）樣品在采樣之后的 72 小時(shí)之內(nèi)要完成前處理，已染色之樣本玻片應(yīng)保存在暗處及 0 至 8 ℃ 冰箱中。
（三）已染色樣本最好能立即鏡檢觀察，至遲在 72 小時(shí)之內(nèi)要完成觀察計(jì)數(shù)。如果染色之效果不佳，則必須縮短保存期限或者提高 DAPI 染劑之濃度。

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