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雷射掃描雷射掃描共軛焦顯微鏡

1. 何謂雷射掃描共軛焦顯微鏡

        在一般顯微鏡下所觀察的影像，都有來自聚焦面 ( focal plane ) 及 非聚焦面 ( out-of focal plane ) 的光，故所提供的影像品質(zhì)解析較差，也無法一層一層的深入樣品作顯微觀察。

        共軛焦顯微技術(shù)利用通過光學(xué)針孔光圈 ( pinhole ) 蒐集來自樣品聚焦面的光所行成的影像，將非同一聚焦面的光排除于光學(xué)針孔光圈外所形成的共軛焦點影像( confocal image )，去除傳統(tǒng)顯微鏡影像的迷光 ( stray light ) 能提供更高的光學(xué)解析，提供更佳的 axial 及 lateral 解析 ( point spread function )。(見圖 1)

        透過此種技術(shù)，使用人員可任意依照樣品的厚度，指定樣品的上下點位置，設(shè)定每一光學(xué)切片的厚度，做連續(xù)的光學(xué)斷層掃描 (如圖 2) ；最后，可重組為一個立體影像 (如圖 3) 、連續(xù)式的3D電影放映 (如影片 1) ，也可作各種角度的旋轉(zhuǎn)或切面觀察 (如影片 2) 。 

2. 雷射掃描共軛焦顯微鏡系統(tǒng)的組成

        雷射掃描共軛焦顯微鏡系統(tǒng)，主要是由包含 A. 雷射光源  B. 顯微鏡  C. 共軛焦掃描器  D. 電腦操控工作站  E. 應(yīng)用軟體 所組成的。

A. 雷射光源

        雷射光源可提供極純的單一波長 (monochromatic)，能量均一性 (high photon, energy)，且雷射光束俱有固定的相位 (coherence)，這些特性使得雷射光束可聚焦于一小點，所以可以有效的當(dāng)作顯微掃描光源。

　　雷射光源包括

a.可見光雷射光源 (visible laser)：

   包括離子雷射、氦氖雷射以及二極 體雷射。

b.紫外光雷射光源 (UV Laser)：包括氦鎘雷射和氫離子紫外光雷射。

c.紅外光雷射光源 (IR Laser )： Ti-sapphire Ultrafast laser。

(本實驗室配備的雷射光源可參看「本實驗室配備」)

B. 顯微鏡

·    目前的共軛焦系統(tǒng)絕大部份都可使用于正立或倒立顯微鏡，掃描器可切換組裝于兩款顯微鏡。

·    對UV和IR提供較高且較寬的波幅修正。

·    光學(xué)鏡頭使用高光學(xué)解析的高NA油鏡，如PL-APO 40x/1.25 Oil，PL-APO 63x/1.32 Oil，PL-APO 63x/1.40 Oil，PL-APO 100x/1.32，PL-APO 100x/1.40。

C. 共軛焦掃描器

·    採用高解析的point-scanning 的掃描感測系統(tǒng)，基本上，有傳統(tǒng)式的濾鏡系統(tǒng)( filter-based )及新一代的分光光譜系統(tǒng) (spectral-based)，本實驗室的配備屬于后者。

·    在濾鏡系統(tǒng)設(shè)計上，主要是利用X-Y掃描鏡來作樣品X-Y座標(biāo)取像，以Z-stage的升降作為Z-軸的縱身掃描取向，故X-Y-Z在配合時序的控制 (T) 即可作多樣性的組合掃描應(yīng)用，例如X-T，Y-T，XY，XY-T，XYZ，XYZ-T ……等。

·    掃描器的反射螢光偵測可使用CCD Camera或PMT (photomultiplier) 來作為光子的感測；至于一般穿透光影像擷取如相位差 (phase contrast)， 則是由安裝于顯微鏡內(nèi)的穿透光感測器所偵測的。

·    本實驗室配備的掃描器為旋轉(zhuǎn)式K型掃描器 (K-scanner)，能提供任何掃描速度的超高光學(xué)解析及多度空間的掃描 (nD : multi-dimentional scanning)，其解析度達4096 x 4096 x 4096像素。

D. 電腦操控工作站

·    電腦系統(tǒng)必須能穩(wěn)定的操控所有軟硬體。

·    使用人員應(yīng)建立自己的影像處理工作站，以共軛焦系統(tǒng)為影像擷取中心，再將結(jié)果單向傳輸至個人的電腦作進一步的編輯處理。

E. 應(yīng)用軟體

·    高階高速的影像處理軟體，人性化的簡易操作是發(fā)展的趨勢。目前，都往 Windows NT 或Windows XP 的作業(yè)環(huán)境發(fā)展。

·    應(yīng)用軟體除了影像擷取及3D立體重建外，長時間影像擷取記錄，細胞生理離子流應(yīng)用，多重螢光分析，自動編輯程式等，都已是頗為成熟的發(fā)展。

3. 雷射掃描共軛焦多光子(雙光子)影像技術(shù)

        在雷射掃描共軛焦顯微鏡的應(yīng)用裡，一般都必須使用高能量 (較短波長) 激發(fā)光源來激發(fā)螢光染劑，因為此高能量才足以改變分子能階，并在回到穩(wěn)態(tài)時釋出較長波長的螢光。所以，一般光源都使用高能量的單光子(single-photon) 可見光雷射 (Ar-Kr / He-Ne laser) 或紫外光雷射 (Ar-UV laser)。然而，螢光染劑的分子本身并不管此激發(fā)能量是否來自單光子、雙光子或更多的光子所攜帶的能量，只要能量足夠改變基態(tài)能階即可。 (如圖 4)

       因此，如果同時使用 2 個以上的雙倍波長光子的能量，以能量相加的交互共同方式，來激發(fā)螢光染劑，則此共同的能量，就如同單光子的能量，足以改變能階，并促使螢光染劑釋出與單光子激發(fā)后所產(chǎn)生的相同波長的螢光，此即表示雙光子技術(shù)。例如 : DAPI 的 Ex (激發(fā)光) : 359 nm，Em (釋放光) : 461 nm，我們可使用單光子雷射 Ar-UV laser (約351 nm) 來激發(fā)，也可使用雙光子雷射 Ti-Sapphire (約702 nm) 來激發(fā)，同樣可得到相同波長 461 nm 的螢光。

       如果同時使用更多個光子共同來激發(fā)螢光染劑，使其產(chǎn)生與單光子激發(fā)后所產(chǎn)生的相同波長的螢光，此即表示多光子技術(shù)。

4. 使用雙光子雷射掃描影像技術(shù)的優(yōu)點

·  可依應(yīng)用，適度取代紫外光雷射 (UV) :

·    紫外光雷射為單光子且造價昂貴。

·    紫外光因光傷害問題，無法使用于活體細胞。

·    紫外光極易散射 (high UV-scattering)，傳輸與穿透不易，會沉降在樣品的表面層，就如同曬傷，致使樣品熱傷害。

·    紫外光造成毒害，致使 DNA 傷害。

·   增加取樣的深度，能更深入樣品裡層。

·   減低螢光漂白的速率，增加螢光觀察與掃描時間。

·   使用多種染劑時，呈像無色差現(xiàn)象。

·    較容易將激發(fā)光與釋出光的波長分開，螢光影像比較不會有重疊現(xiàn)象 (cross-talk)。

·    無須感測光針孔，所以反射螢光可 100% 被感測。

·    可使用絕大部份的螢光染劑，尤其是須使用紫外光光源所激發(fā)的雷射。

·    有效的應(yīng)用于胞外或胞內(nèi)離子流定量分析及螢光影像。

·    適用長時間影像擷取記錄。

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