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正文:

顯微鏡(The Microscope)

目的：

l. 明瞭複式顯微鏡的構(gòu)造、使用及保護(hù)方法．
2. 學(xué)習(xí)如何利用複式顯微鏡做顯微測量．

原理：

自虎克(Hook,

最頻繁的工具之一，人類因顯微鏡的使用，而拓展了視野，一些微小的細(xì)菌、微生
物、細(xì)胞和組織都能觀察到 ; 而電子顯微鏡的發(fā)明，更進(jìn)一步使我們可觀察直徑約l0
nanometer (nm)大小物體，如蛋白質(zhì)或核酸分子。
顯微鏡主要的功用在于能將影像放大(magnification)，然而放大后影像的品質(zhì)
卻決定于顯微鏡的解像力(resolution)。一般光學(xué)顯微鏡其解像力理論上可達(dá)到0.2
µm．但因受光的性質(zhì)(光具有折射、繞射等性質(zhì))、透鏡的材料、及顯微鏡製造的
技術(shù)影響，致使觀查值無法達(dá)到0.2 µm。另一方面影像的明暗對比(contrast)也會影

響觀察，可以利用各種染色法來處理材料或特殊裝置來增加影像的對比，以利于
觀察。這些有特殊裝置的顯微鏡有相位差顯微鏡(Phase contrast microscope)、干涉
顯微鏡(Differential interference contrast microscope (或稱為Nomarski)及螢光顯微鏡
(Fluorescence microscope)等。近年來發(fā)明了共軛焦顯微鏡(Confocal microscope)，影

像經(jīng)由數(shù)位化的處理，解析度增加，甚至形成三度空間的影像，對生命科學(xué)的研究
有極大的幫助，然而本實(shí)驗(yàn)只介紹普通的光學(xué)顯微鏡。

複式光學(xué)顯微鏡(The Compound Microscope)

一﹑顯微鏡的構(gòu)造(圖一) ：
l. 鏡座(Base)為顯微鏡之最底部，支持顯微鏡各部份。
2. 鏡柱與鏡座相連之短柱，可支持鏡臂及載物臺。
3. 鏡臂(Microscope stand或Arm)上有鏡筒(Binocular tube或Body tube)，為提取或移動時握手之處。
4. 鏡筒(Binocular tube)鏡臂上圓筒部份，上接「接目鏡，下接旋轉(zhuǎn)盤，內(nèi)有透鏡
系統(tǒng)，若鬆動其底部之固定螺絲，可使鏡筒在平面上作360度的旋轉(zhuǎn)。
5. 旋轉(zhuǎn)盤(Revolving nosepiece)接于鏡筒下端之固盤，盤上接3至4個接物鏡可旋
轉(zhuǎn)，以便更換接物鏡。
6. 接物鏡(Objective)裝于旋轉(zhuǎn)盤上，通常有4X、l0x、40X及l(fā)00X等。
7. 接目鏡(Eyepiece或Ocular)插于鏡筒上，將接物鏡所放大之物像再放大若

1655)利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞以來，顯微鏡已是生物學(xué)上使用
通常有l(wèi)0X及l(fā)5X。
8. 調(diào)節(jié)輪(Adjustment knob)使鏡筒升降(或載物臺升降)以調(diào)節(jié)焦點(diǎn)用﹔粗調(diào)節(jié)輪
(Coarse adjustment knob)轉(zhuǎn)一週可調(diào)整10-20 µm，細(xì)調(diào)節(jié)輪(Fine adjustment
knob) 轉(zhuǎn)一週可調(diào)整0.2-1.0 µm。
9. 載物臺(Mechanical stage)放置玻片之平臺，中央圓孔可使光線通過。
10. 玻片夾(Specimen holder或Slide clip)可固定玻片標(biāo)本，具有機(jī)械鏡臺
(Mechanical stage)，利用二個齒輪，轉(zhuǎn)動時可前后左右移動標(biāo)本。
11. 集光器(Condenser)由多數(shù)透鏡組合而成，集合光源照到標(biāo)本上，集光器可上、

下調(diào)整。
12. 光源(Light source)位于集光器之下，有一電源開關(guān)(Power switch)。

二 顯微鏡的使用：
甲. 低倍鏡用法
1. 由箱內(nèi)取顯微鏡出來時，用右手握住鏡臂，左手托住鏡座，鏡臂向內(nèi)輕輕

放置桌上距桌緣處。
2. 用拭鏡紙輕拭鏡面。
3. 轉(zhuǎn)動旋轉(zhuǎn)盤，使低倍接物鏡與鏡筒筆直相接。
4. 雙眼同時對準(zhǔn)雙目鏡(若為單目鏡，用左眼對準(zhǔn)接目鏡，右眼必須睜開)戴眼

鏡者取下眼鏡觀察，然后調(diào)節(jié)光圈使視野光度明亮均勻。
5. 將玻片標(biāo)本置載物合之圓孔上，固定兩端。
6. 慢慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)輪，眼晴注意接物鏡，使鏡筒下降(或載物臺上升)至物鏡
離玻片l mm處(或直到無法再下降為止)，然后再以雙眼對準(zhǔn)目鏡，轉(zhuǎn)動粗
調(diào)節(jié)輪使鏡筒徐徐上升(或載物臺下降)直至物像明晰，再用細(xì)調(diào)節(jié)輪，使

物像更加明晰，細(xì)調(diào)節(jié)輪儘童不要轉(zhuǎn)過一或二圈，若轉(zhuǎn)到停止時，仍未得
清晰物像，則先將粗調(diào)節(jié)輪往上轉(zhuǎn)后，再使用細(xì)調(diào)節(jié)輪，若光線太強(qiáng)或太
弱，可調(diào)節(jié)光源的強(qiáng)若使光度適宜。

乙. 高倍鏡用法
1. 依前法先用低倍鏡找出欲觀察之部位，將其移至視野中心。
2. 換用高倍鏡時，鏡頭與玻片距離甚近(40X接物鏡與蓋玻片間可調(diào)距離僅0.6
mm)轉(zhuǎn)動調(diào)節(jié)輪須特別小心，以免鏡頭觸及玻片標(biāo)本，損壞鏡面或標(biāo)本(若
為等焦點(diǎn)顯微鏡Parfocal，需略為轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)輪，使鏡筒徐徐上升至物像
出現(xiàn)后再轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)輪1/4轉(zhuǎn)即可)
3. 雙眼由接目鏡注視并轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)輪，使視野中成像更加清晰。
4. 若在高倍鏡下不見物像時，應(yīng)換回低倍，依前法再找到物像，將欲檢視部
位移至視野中心仁再用高倍鏡。

器材：

顯微鏡
載玻片、蓋玻片
鑷子(Forceps)
解剖針(Dissecting needle)
刀片(Razor blade)
拭鏡紙(Lens paper)
牙籤(tooth pick)
滴管(Dropper)
l%碘液(Iodine sol'n)
0.05% 甲基藍(lán)(Methylene blue)
0.1% 蘇丹液(Sudan oil)
1X 生理鹽水(PBS)

洋蔥
薑的根莖、黃花
馬鈴芽的塊莖
香蕉的果實(shí)
印度橡膠樹或榕樹的葉片
豬肝
豬肉或雞肉(含肥肉、瘦肉)

方法：

一﹑植物細(xì)胞
1. 表皮細(xì)胞(Epidermal cell)
將一個洋蔥切成四等分如圖一(A)所示，然后取一片內(nèi)側(cè)鱗葉，并把它剝成兩
半如圖一(B)，利用鑷子,由斷成兩半的毛邊上，撕下一小塊表皮組織如圖一
(C)，然后將它放在載玻片上并且滴上一滴水，使組織展開來，最后覆上蓋玻
片如圖一(D)，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，再用碘液(Iodine solution) 或甲基
藍(lán)(Methylene blue)一滴加于蓋玻片 之一側(cè)，然后以濾紙自蓋玻片之另一側(cè)吸

乾多馀的溶液(圖二)，使洋蔥表皮細(xì)胞獲得均勻之染色.再觀察時，注意各細(xì)
胞被染色后那些構(gòu)造可看得更清楚?

2. 淀粉粒(Starch granules)

用刀片在馬鈴薯塊上刮，然后取其汁液于載玻片上，加一滴水覆上蓋玻片，
用顯微鏡觀察。
(l) 注意淀粉粒之大小。(圖三A)
(2)可否見到淀粉顆粒之同心圓層?圓心為臍(Hilum)。
(3)加碘液后觀察（如步驟一的加染劑的方法），有何不同?
(4)用刀片刮取香蕉果肉少許觀察其淀粉粒的形狀。(圖三B)

3. 油滴(Oil body)
油滴為細(xì)胞產(chǎn)物的一種，遇蘇丹液(Sudan oil)會產(chǎn)生紅色反應(yīng)，薑根莖的皮層
細(xì)胞內(nèi)常可見到黃色的油滴。如同上兩步驟， 用蘇丹液染色觀察。

4. 保衛(wèi)細(xì)胞(Guard cell)

取榕樹或印度橡膠樹葉片，撕下其下表皮，置載玻片上加水，覆以蓋玻片，
用顯微鏡觀察在其下表皮中，是否有半月狀之保衛(wèi)細(xì)胞?(用繪圖表示所見之保
衛(wèi)細(xì)胞)

5. 雜色體(Chromoplasts)取一黃色花冠、胡蘿卜或蕃茄果實(shí)，設(shè)法弄成薄片，蓋上

蓋玻片后，放在顯微鏡下觀察，注意細(xì)胞內(nèi)雜色體之形狀、大小、位置。
6. 徒手切片

至校園中摘取一種植物葉片，將葉片製入有缺口的胡蘿卜塊，用刀片進(jìn)行徒
手切片（見助教的示范）。

二．動物細(xì)胞
l. 肌肉細(xì)胞(Muscle cell)

取少許的肌肉纖維（眼睛稍微可見），置載玻片上，用鑷子儘可能地去展
開，加生理鹽水一滴，再加蓋玻片，先用低倍鏡觀察，再用高倍鏡觀察。
(1)是否見到橫紋?
(2)是否見到細(xì)胞核 ?
(3)可否見到肌小纖維?
用甲基藍(lán)染色， 是否增加細(xì)胞核的可見度？

2.脂肪細(xì)胞(Fat cells)

取少許皮下脂肪，涂成薄層，加蘇丹液一滴，先在低倍鏡下觀察，再換高
倍，細(xì)胞內(nèi)染成紅色部份為油滴．
(l)各細(xì)胞內(nèi)之油滴大小是否一樣?
(2)細(xì)胞核位于何處?
(3)油滴的來源如何?

3. 肝細(xì)胞(Liver Cell)

取一小片豬肝置于加有生理食鹽水之載玻片上，涂抹后再加一滴甲基藍(lán)液，
覆以蓋玻片，在顯微鏡下觀察肝細(xì)胞的細(xì)胞核有幾個?

4. 口腔上皮細(xì)胞(The epithelial cell of oral cavity)

取一張清潔的載玻片，在載玻片的中央加一滴生理鹽水，然后以消過毒的牙
籤粗端刮取自己頰內(nèi)皮膜少許，置于載玻片上之生理鹽水內(nèi)，覆上蓋玻片，
在蓋玻片之一側(cè)加一滴甲基藍(lán)或碘液，然后以濾紙自蓋玻片之另一側(cè)吸之，
最后置于顯微鏡下觀察。
請任選動植物細(xì)胞個二，做大小的比較。

定量操作目的：
原理：

所有物質(zhì)都具有吸收和反射光的特性，不同的物質(zhì)或同一物質(zhì)存在于不同濃度的溶
液中具有吸收和反射不同波長或不同程度的光。簡單的說某種物體呈現(xiàn)某一顏色，
即是這個物體反射代表此一顏色波長的光，而吸收了其馀波長的光。我們平�？吹�

的綠色物體，即顯示這個物體所反射的綠色光，而其馀波長的光被吸收了。

分光光度計在生物實(shí)驗(yàn)中，往往被用來決定溶液中是否含有某一特定物質(zhì)及其濃
度。其中的原理是每一原子，分子和化學(xué)鍵結(jié)均能吸收光，因此每一種物質(zhì)含有不
同的吸收光譜，譬如，胞密啶(cytosine)和鳥糞嘌呤(adenine)的化學(xué)構(gòu)造不同，它們的

吸收光譜亦不同，因此由鑑定吸收光譜的差異性可用來分辨不同的物質(zhì)。其次用某
一特定波長的光照射一溶液，由于溶液中的物質(zhì)可吸收一部分的光，光被吸收的量
和物質(zhì)在溶液中的濃度成正比，由此可測定溶質(zhì)在溶液中的濃度。

分光

1. 波長調(diào)整按鍵
3. 波長顯示
5. 測定管(cuvette)置入樣品槽

分光
品及

光度計主要含有：光源，濾片，樣
光度偵測器四個部分。
光源，用來提供白光 [可見光的波長
范圍是從380到750 nm ( nanometer)]，它是由許多不同波長的有色光所組成。此外

光度計可用在可見光范圍以外的光，包括紫外線和紅外線，但需要特殊的光源來
產(chǎn)生這種波長的光，這次的實(shí)驗(yàn)中只作可見光。
濾片，用來讓不同波長的光通過。一個稜鏡把可見光分成紅橙黃綠籃靛紫等有色
光，利用調(diào)整稜鏡的角度，以便選用特定波長的光﹔或者利用不同顏色的濾片來讓
不同波長的光通過。

如何正確及且準(zhǔn)確地使用吸管(pipet)和微量吸管(pipetman)
如何正確地使用分光光度計
如何建立一個物質(zhì)的吸收光譜(absorption spectrum)
製作及使用一個標(biāo)準(zhǔn)曲線去決定未知溶液之濃度
光度計

2. 歸零按鍵
4. 吸光度( Absorbance)指示表

樣品，置于一個裝溶液的玻璃，石英或塑膠容器，叫做測定管（Cuvette），當(dāng)測定

管裝了溶液即可放入光度計內(nèi)的測定管置入樣品槽，去量取吸光值。
光度偵測器(Photodetector)，這個儀器可將光線轉(zhuǎn)變成電流，其功用是偵測穿透光的

強(qiáng)度，再由儀器上的儀表所顯示其吸收或穿透值，這些值是由光度偵測器產(chǎn)生的
電流量轉(zhuǎn)化而來的。

刻度吸管
刻度吸管和微量吸管(pipetman)可以準(zhǔn)確地量取微量的液體，因此如何正確地使

用吸管去準(zhǔn)確的量取液體，在現(xiàn)代生物學(xué)中是一個非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
注 :1公升=103毫升(ml)=106微升(µl)

本實(shí)驗(yàn)將要讓各位同學(xué)練習(xí)如何使用安全吸球，刻度吸管，微量吸管及分光光
度計

標(biāo)準(zhǔn)曲線（這是一個非常重要的定量方式）

用已知濃度的溶液，先做一連續(xù)的稀釋，讓這些稀釋液的吸光殖在0.1到1.0之間（最
好在0.1-0.5），在讀取所有稀釋濃度的吸光值后，用方格紙作濃度（X軸）對吸光值
（Y軸）作圖，所得的曲線即是標(biāo)準(zhǔn)曲線（見上圖）；對未知溶液一樣地去讀取吸光
值（其值最好在0.1-0.5），利用這一個讀值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上去做交叉比對，就可以知
道未知溶液的濃度，比如說， 未知溶液的吸光值是0.4，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所對應(yīng)的濃度
室0.38，未知溶液的濃度應(yīng)是0.38 mg/ml（沒有稀釋的情形下）。

器材：

分光光度計(spectrophotometer)
刻度吸管(pipet)

方法：

1 、練習(xí)如何操作安全吸球及吸管（見示范后練習(xí)之）

2 、決定CoCl2和CuSO4的吸收光譜
因?yàn)槊恳环N物質(zhì)具有一定的吸收光譜，本實(shí)驗(yàn)是利用CoCl2和CuSO4的吸收光譜來

練習(xí)如何操作分光光度計及製作吸收光譜。
注意：實(shí)驗(yàn)前，打開分光光度計暖機(jī)15分鐘。

每組先取9根試管和一個未知濃度的CoCl2和CuSO4溶液。

標(biāo)示每一試管如下。
先製備100mg/ml的CoCl2濃溶液，并作一系列的稀釋溶液(如下表)，每一稀釋度作
兩根管子A管和B管，如1A和1B即是相同濃度，這一不可以偵測定量操作的再現(xiàn)

性。

本實(shí)驗(yàn)首先使用試管4A (50 mg/ml) 和0 (不含CoCl2)來讀取吸光值以決定CoCl2溶
液的最佳吸光波長。試管0作為歸零(Blank)之用。

出自http://www.bjsgyq.com/北京顯微鏡百科