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正文:

以HPLC純化蛋白質(zhì)-生物顯微鏡技術(shù)

此法亦有以分子大小, 離子交換, 逆相, 厭水性交互作用等不同方式.

HPLC適于微量蛋白質(zhì)的分離, 且可在短時(shí)間內(nèi)達(dá)成. 逆相法場會(huì)使蛋白質(zhì)分子失去生物活性, 離子交換與厭水性法均無此缺點(diǎn), 分子大小法所分的分子大小范圍會(huì)比普通用的柱狀層析小一半, 且可對(duì)很小量的樣本進(jìn)行分離. 此處僅介紹以分子大小來分離蛋白質(zhì)的方法. 此法依蛋白質(zhì)分子大小, 大分子先分出, 小分子后分出.

材    料：

degassed, HPLC-grade H2O
size-exclusion(SE) buffer
SE protein standards
0.75×30cm SE column

方    法：

1.將保存液(storage solvent) (此處使用methanol)由column中洗除(用degassed HPLC-grade H2O), 以flow rate 1ml/min.

(在使用完之后, 以水洗去buffer salts, flow rate 1ml/min 30min, 再以methanol洗column 30min, 1ml/min)

2.在室溫下使SE column平衡于1ml/min, H2O中.

3.試測一次, 以100μl SE buffer來測, 將結(jié)果列印紙上畫上一橫表示開始處, 并設(shè)定紙的速度為0.5cm/min, 而吸收度的單位則應(yīng)依蛋白質(zhì)濃度調(diào)整, 0.1宜于100pmol, 0.3宜于500pmol, 0.5宜于1nmol,1.0宜于2nmol, 若結(jié)果顯示有污染之峰波, 且經(jīng)一在測驗(yàn)均無法消除, 則buffer或column或二者均要更換了.

4.將SE蛋白標(biāo)準(zhǔn)液離心5min, 2,000xg, 抽取100μl測試, 如果峰高超過列印紙大小, 可調(diào)整之, 若結(jié)果比void volumn大于2.5倍以上, 則表示蛋白質(zhì)吸附在column上.

5.決定每個(gè)峰的elution volume, 在繪以log10為縱軸, 各峰之elution volumn(ml)為橫軸的圖, 以便做測未知標(biāo)本的參考.

6.接下來座標(biāo)本. 方法比照過程3, 4.

SE buffer配方：

20mM Sodium acetate, pH5.6

150mM NaCl

SE protein standards：

2.0mg thyroglobulin

4.0mg catalase

3.0mg bovine serum albumin

3.0mg ovalbumin

4.0mg ribonuclease A

再加6ml SE buffer并緩緩溷合, 必須完全溶解, 并應(yīng)在顯微鏡下查看無沉淀后, 在離心一次, 取上清液使用.

附注：

1.SE HPLC 層析法, 所得的每個(gè)蛋白質(zhì)的elution volume與各蛋白質(zhì)的log10(分子量)有關(guān).

2.SE buffer亦可用Sodium phosphate(pH5~8)并含0.1~0.4M之NaCl.

3.所得之結(jié)果可再以電泳法來測分子量.

4.SE-HPLC層析柱之選擇, 可參考如下：

Toya Soda SW

G 2,000 SW 用于分子量30,000以下

G 3,000 SW 用于分子量30,000至500,000

G 4,000 SW 用于分子量500,000

出自http://www.bjsgyq.com/北京顯微鏡百科